Celem działania były pilotażowe badania laboratoryjne wektorów na obecność patogenów nieobjętych obecnie systemem nadzoru epidemiologicznego na terenach rekreacyjnych wybranych 3 miast w różnych województwach, w minimum trzech różnych lokalizacjach w danym mieście. Wykorzystano techniki badań (technika zbierania kleszczy i określenie skali zagrożenia atakami kleszczy, odsetek zakażonych kleszczy na poszczególnych stanowiskach) służących do szacowania stopnia narażenia grup ludności na poszczególne patogeny oraz narażenia na wektory przenoszące czynniki chorobotwórcze.
Zbiory kleszczy prowadzono w następujących lokalizacjach:
- Warszawa: Łazienki Królewskie, Las Kabacki, Las Bielański
- Olsztyn: Skanda, Las miejski, Plaża Miejska
- Poznań: Uroczysko Golęcin, Cytadela, Uroczysko Malta.
Na podstawie własnych doświadczeń oraz przeglądu literatury przygotowano procedurę „Instrukcja dotycząca odłowu kleszczy w środowisku naturalnym metodą flagowania”.
Od początku kwietnia 2019r. do końca lipca 2020r. przeprowadzono zbiory kleszczy metodą flagowania we wszystkich trzech wytypowanych miastach (po 3 lokalizacje w każdym mieście). Zebrano łącznie 2568 kleszczy (w tym także z gatunku Dermacentor) w 2019 roku i 2218 w 2020 roku. Otrzymano do nich bazy danych zawierające szczegółowe informacje o dacie zbioru, temperaturze, wilgotności i ilości osobników na poszczególnych stanowiskach. Zbiory przeprowadzano dwukrotnie w roku: w kwietniu i maju oraz w czerwcu i lipcu.
Kleszcze jako zagrożenie w parkach miejskich
Skalę zagrożeń atakami kleszczy na miejskich terenach rekreacyjnych Warszawy, Olsztyna i Poznania opracowano na podstawie opublikowanej metodyki i kryteriów (M. Supergan, G. Karbowiak. Przegl. Epidemiol. 2009;63:67-71). W formie graficznej w portalu przedstawiono obszary i liczbę kleszczy odłowionych metodą flagowania przez jedną osobę w ciągu jednej godziny, w powtarzalnych warunkach (po przeliczeniu na osobo/godzinę).
Zastosowano następującą skalę zagrożenia:
liczba kleszczy >50 – obszar o bardzo dużym ryzyku
liczba kleszczy 26-50 – obszar o dużym ryzyku
liczba kleszczy 11-25 – obszar o średnim ryzyku
liczba kleszczy 4-10 – obszar o średnio-niskim ryzyku
liczba kleszczy 1-3 – obszar o niskim ryzyku
Warszawa
Analiza liczby kleszczy wykazała, że największe ryzyko związane z atakami kleszczy występuje w okresie wiosennym (kwiecień) w Łazienkach Królewskich (bardzo duże ryzyko) oraz w Lasku Bielańskim (duże ryzyko). Dla tych dwóch lokalizacji, stwierdzono różnice w występowaniu zagrożenia pomiędzy latem 2019 (odpowiednio zagrożenie średnie i średnio-niskie) a latem 2020 (duże ryzyko). Las Kabacki stanowił obszar najbardziej bezpieczny. Ryzyko kształtowało się na poziomie średnio-niskim i niskim w 2019 roku i średnim w 2020.
Olsztyn
We wszystkich trzech lokalizacjach badanych terenów rekreacyjnych występowało bardzo duże i duże zagrożenie atakami kleszczy niezależnie od pory roku.
Poznań
Rejonami o największym ryzyku kontaktu z kleszczami były tereny Uroczysko Golęcin (obszar o bardzo dużym i dużym ryzyku) oraz Uroczysko Malta (obszar o bardzo dużym ryzyku) w badanych okresach wiosennych i letnich. Obszar Cytadeli to obszar średniego i średnio-niskiego zagrożenia atakami kleszczy.
Badania laboratoryjne kleszczy zebranych w parkach miejskich
Metodą flagowania zostały pobrane próby kleszczy ze środowiska jaki stanowiły parki miejskie, Uzyskane kleszcze zostały podzielone na grupy wg. fazy rozwojowej. W celu wykrycia chorobotwórczych patogenów, bakterii z rodzaju Anaplasma, oraz pierwotniaków z rodzaju Babesia zostały wykorzystane metody biologii molekularnej.
Na podstawie cech morfologicznych oznaczono gatunek, stadium rozwojowe i płeć poszczególnych osobników. Do czasu wykonania analiz kleszcze przechowywano w temp – 30°C. Przed izolacją DNA kleszcze pulowano w próby o następującej ilości osobników: nimfy – 15 sztuk, larwy – 10 sztuk, samice – 5 sztuk, samce – 5 sztuk. Do badań przygotowano 271 prób DNA pul kleszczy w 2019 roku i 348 w 2020 roku.
Na podstawie doświadczeń własnych i danych z piśmiennictwa opracowano metodykę izolacji DNA z kleszczy i metodykę badań molekularnych. Do izolacji wykorzystano zestaw komercyjny Sherlock AX (A&A Biotechnology) posługując się instrukcją producenta zmodyfikowaną do celów własnych.
DNA Babesia amplifikowano przy użyciu metody własnej HRM real-time PCR oraz metody PCR dostoswanej do badań własnych (Rożej-Bielicka i wsp. 2017, Bonnet i wsp. 2007)
DNA Anaplasma phagocytophilum amplifikowano przy użyciu metody własnej (In-house PCR), wykorzystując zestaw QIAGEN – HotStarTaq Plus Master Mix oraz startery o opublikowanej sekwencji (Pancholli i wsp. 1995)
Przeprowadzone badania molekularne na próbkach pulowanych i analiza sekwencji wykazała występowanie zoonotycznych i niezoonotycznych pierwotniaków Babesia we wszystkich badanych miastach. W okresach wiosennych 2019 i 2020 roku B. canis i B. divergens wykryto w Olsztynie odpowiednio w 2,4% i 4,8% prób, a w Poznaniu w 10,9% i 1,5% prób. B. venatorum wykryto w 4,4% prób w Warszawie, w 2,4% w Olsztynie i 3,1% w Poznaniu. Materiał genetyczny B. microti stwierdzono w 4,4% prób spulowanych kleszczy w Warszawie i 3,1% w Poznaniu.
W okresach letnich 2019 i 2020 roku B. canis wykryto w 8,3% prób w Warszawie i 1,5% w Olsztynie. W Poznaniu stwierdzono obecność B. venatorum w 2% prób. W okresach tych nie wykryto B. divergens i B. microti.
W części prób, ze względu na duże zanieczyszczenie DNA nie udało się określić gatunku pierwotniaków babeszja i sklasyfikowano je jako Babesia spp. W sezonach wiosennych 2019 i 2020 roku stwierdzono je w Warszawie, Olsztynie i Poznaniu w odpowiednio 15,5%, 14,6% i 23,4% prób odławianych kleszczy. W sezonach letnich w tych samych miastach DNA Babesia spp. stwierdzono odpowiednio w 25%, 9% i 18,7% prób.